ГОСТ 20909.4-75 Сперма быков неразбавленная. Методы биологических исследований

УДК 619:611 -013.11:620.193.8(063.74) Группа Р39

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

СПЕРМА БЫКОВ НЕРАЗБАВЛЕННАЯ Методы биологических исследований

Non-diluted sperm of bulls Methods of biological tests

ГОСТ

20909.4-75

Постановлением Государственного комитета стандартов Совета Министров СССР от 19 сентября 1975 г. № 2440 срок действия установлен

с 01.07.76 до 01.07.81

Несоблюдение стандарта преследуется по закону

Настоящий стандарт распространяется на неразбавленную свежеполученную сперму быков и устанавливает методы испытаний биологических свойств спермы — подвижности спермиев, абсолютной выживаемости и выживаемости спермиев в часах, осмотической (физиологической) резистентности, активнэсти дегидрогеназ и резистентности спермиев к холодовому шоку.

1. МЕТОД ОТБОРА ПРОБ

1.1. Отбор проб — по ГОСТ 20909.1—75.

1.2. Для проведения испытаний используют сперму, хранившуюся при температуре 30—35°С не более 30 мин с момента ее получения.

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОДВИЖНОСТИ СПЕРМИЕВ

Сущность метода заключается в определении количества спермиев с прямолинейным поступательным движением.

2.1. Оборудование и реактивы

2.1.1. Для проведения испытания применяют:

микроскоп биологический марки МБИ или МБР по ГОСТ 8284—67;

термостат ТМ-1 или другой конструкции, снабженный стандартным контактным или нестандартным однотемпературным термометром;

Издание официальное Перепечатка воспрещена

стекла покровные по ГОСТ 6572—59;

стекла предметные по ГОСТ 9284—59;

стекла предметные с углублением;

палочки стеклянные или пипетки пастеровские;

натрий лимоннокислый трехзамещенный по ГОСТ 5.1314—72, 3%-ный раствор;

натрий хлористый по ГОСТ4233—66, 1%-ный раствор.

2.2. Подготовка к испытанию

2.2.1. Подготовка и стерилизация лабораторной посуды — по ГОСТ 20909.2—75.

2.2.2. Термостат включают за 20—30 мин до начала работы. Температура в термостате должна быть 40—42°С.

2.2.3. Предметные и покровные стекла, стеклянные палочки, пипетки и растворы подогревают до 35—40°С.

2.3. Проведение испытания

2.3Л. Подвижность спермиев определяют в раздавленной капле спермы под микроскопом в проходящем свете при увеличении 100—180^х. Более точно количество живых и мертвых спермиев определяют в счетной камере по ГОСТ 20909.3—75.

2.3.2. При определении подвижности спермиев под микрсскопом наносят на предметное стекло теплой стерильной стеклянной палочкой или пастеровской пипеткой небольшую каплю спермы, к которой добавляют двух-четырехкратное количество 3%-иого раствора лимоннокислого натрия. Сперму с раствором лимоннокислого натрия тщательно перемешивают и накрывают покровным стеклом. Просматривают под микроскопом весь препарат. Подсчет спермиев пре изводят не менее чем в трех полях зрения микроскопа с наибольшей подвижностью спермиев. Подсчитывают количество спермиев с прямолинейным поступательным движением и отдельно — количество спермиев с неправильным движением — манежным (перемещение по кругу), колебательным (сперм и и не перемещаются, но производят движение головкой или хвостиком) и мертвых спермиев.

2.4. Обработка результатов

2.4.1. Подвижность спермиев (П_с ) в баллах вычисляют по формуле

_я rv_10_

^С П ⁹

где п — общее число подсчитанных спермиев;

П\ —- число подсчитанных, спермиев с прямолинейным поступательным движением;

10 — по стоянный к о э ффи ди еит.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Минимальной подвижностью спермиев принято считать подвижность, равную 0,6 балла.

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АБСОЛЮТНОЙ ВЫЖИВАЕМОСТИ И ВРЕМЕНИ ВЫЖИВАЕМОСТИ СПЕРМИЕ8

Сущность метода заключается в установлении подвижности спермиев за каждый последовательный интервал времени в процессе хранения спермы после ее разбавления.

Выживаемость спермиев в часах определяют по количеству времени, прошедшего от начала хранения спермы до ее гибели.

3.1. Оборудование и реактивы

3.1.1. Оборудование и реактивы — по п. 2.1;

глюк озо-питратно-желт очная среда — по ГОСТ 14746—69.

3.2. Проведение испытания

3.2.1 .Отбирают из одного эякулята или серии спермы не менее двух проб для анализа, которые разбавляют глюкозо-цитратнэ-желточной средой, приготавливая одно из разведений от 1:8 до 1:32, и сохраняют при 2—5°С.

Подвижность спермиев определяют через каждые 24 ч (в начале хранения можно через 48 ч) по п. 2.3. Последним днем испытания считают день, когда наблюдается единичная подвижность спермиев и нельзя установить минимальную подвижность спермиев в баллах.

3.3. Обработка результатов

3.3.1. Абсолютную выживаемость спермиев (S) вычисляют по формуле

5 = 1lit| #2$2 “Г #3^3 * • • “Ь &п >

где а_{, а_2у а>г ... а_п —подвижность спермиев за интервалы времени, баллы;

t_u t_2y h • • ■ t_n — последовательные интервалы времени, в

течение которых подвижность спермиев соответственно равна а_и а₂, а$...а_п , ч, вычисляемые поп. 3.3.2;

ci\tu a₂t_2i azU .. .a_nt_n—выживаемость спермиев за последовательные интервалы времени.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух или более параллельных определений. Допускаемые расхождения между двумя параллельными определениями не должны превышать ±10%. Если из трех или четырех определений одно имеет расхождение более чем на ±10%, то среднее арифметическое вычисляют соответственно по двум или трем определениям. Если из трех или четырех определений два имеют расхождение более чем на ±10%, то испытание повторяют.

При проведении пяти определений среднее арифметическое вычисляют по трем определениям, при шести или семи определениях — по четырем, при восьми и девяти определениях — по пяти определениям, имеющим расхождение не более ±10%.

3 3.2. Интервалы времени (t_u t₂, /3---) в часах вычис шюг по формуле

fixз =^Тп'^И~^Гп-.¹. ,

где Г — время, прошедшее от начала испытания до дня следующего испытания, ч;

и — порядковый номер дня испытания.

При определении выживаемости спермиев в день испытания, когда нельзя установить минимальную подвижность спермиев, интервал времени (/„) в часах вычисляют по формуле

Тис—Т

п—1

где 7_НС — время выживаемо ста спермиев, ч, вычисляемое по п 3.3 3,

Т_п~ 1 -— время, прошедшее от начала испытания до предпоследнего дня испытания, когда была установлена минимальная подвижность спермиев в баллах, ч.

3.3.3. Время выживаемости спермиев (7\_с ) в часах вычисляют по формуле

rp _ Т П т _{п (} ^

7 нс~~ 2, "Г 7 гг—1*

где Т _п — время, прошедшее от начала испытания до последнего дня испытания, ч.

Результаты испытаний по определению подвижности спермиев при вычислении абсолютной выживаемости и выживаемости спермиев в часах записывают в журнале испытаний. Форма журнала для записи результатов испытаний, а также примеры вычислений абсолютной выживаемости спермиев, интервала времени и выживаемости спермиев в часах приведены в приложениях 1 и 2.

4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСМОТИЧЕСКОЙ! (ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ) РЕЗИСТЕНТНОСТИ СПЕРМИЕВ

Сущность метода заключается в определении устойчивости спермиев к действию гипотонического раствора хлористого натрия. 4.1.Оборудование и реактивы

4.1.1. Для проведения испытания применяют: микроскоп биологический марки МБИ или МБР по ГОСТ 8284—67;

термостат ТМ-1 для микроскопа; флаконы вместимостью 10—15 мл или пробирки; микропипетки стеклянные по ГОСТ 12487—67; колбы стеклянные вместимостью 100—500 мл по ГОСТ 12487—67;

стекла предметные по ГОСТ 9281—59; стекла покровные по ГОСТ 6572 — 59;

натрий хлористый по ГОСТ 4233—66, 0,1—0,6%-ный раствор;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709—72.

4.2. Подготовка к испытанию

4.2.1. При определении осмотической резистентности неразбавленной спермы должны строго соблюдаться правила, предупреждающие холодовый шок спермиев. Растворы и лабораторная посуда, применяемые для проведения испытания, должны быть стерильными и подогретыми до температуры 30—35°С.

4.2.2. Перед испытанием готовят пробирки с концентрацией раствора хлористого натрия от 0,6 до 0,1%. Для этого вначале готовят на дистиллированной воде 1%-ный раствор хлористого натрия, который разливают в девять пробирок в объеме от 0,5 до 3,0 мл в соответствии с таблицей и добавляют дистиллированную воду до объема 5 мл.

При исследовании большого количества проб спермы раствор хлористого натрия в концентрациях от 0 6 до 0,1% готовят в девяти колбах, затем из каждой колбы переносят мерной стеклянной пипеткой тю 5 мл раствора в заранее при готовленные флаконы или пробирки.

4.2.3. Приготавливают по две пробирки с раствором хлористого натрия каждой из указанных в таблице концентраций. Пробирки закрывают резиновыми пробками, обернутыми пергаментной бумагой, и ставят в термостат при температуре 33—35^аС на 10—15 мин.

4.3. Проведение испытания

4.3.1. В каждую пробирку с раствором хлористого натрия теплой микропипеткой вносят по 0,025 или 0,05 мл испытуемой спермы. Получают разбавление от 1:100 до 1:200,

Пробирки с разбавленной спермой выдерживают 3 чпри температуре 18—22Х.

Подвижность спермиев в раздавленной катле определяют по п. 2.3 без добавления раствора лимоннокислого натрия.

4.4. Обработка результатов

4.4.1. Осмотическую резистентность спермы (R₀) выражают

значением концентрации раствора хлористого натрия, при которой подвижность сперм в ев < оставляет не менее 0,5 балла. Чем ниже концентрация раствора хлористого натрия, в котором спермин остаются живыми, тем выше осмотическая резистентность спермы.

Пример. В пробирке № 8 (0,15%-ный раствор хлористого натрия) определена единичная подвижность спермиев, а в пробирке № 7 (0,2%-ный раствор хлористого натрия) подвижность спермиев 0,5 балла. Следовательно, значение осмотической резистентнее™ спермы равно 0,2. Или, если в пробирке № 8 мертвые спермин, в пробирках № 7 и 6 единичная подвижность спермиев, а в пробирке № 5 (0,3%-ный раствор хлористого натрия) подвижность — 0,5 балла. Следовательно, ссмогическая резистентность спермы равна 0,3.

4.42. Коэффициент резистентности (R_K) вычисляют по формуле

где 0,1 — постоянный коэффициент;

R о— осмотическая резистентнс сть (концентрация раствора хлористого натрия, %).

5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДЕГИДРОГЕН АЗ НОЙ АКТИВНОСТИ СПЕРМЫ

Сущность метода заключается в определении сксрссги обесцвечивания метиленовой сини, добавленной к сперме.

Скорость обесцвечивания метиленовой сини зависит от активности дегидрогеназ-ферментов дыхания опермиев.

Детидрогеназную активнсегь спермы определяют в капиллярах или в пробирках.

5.1. Метод определения дегидрогеназной активности спермы в капиллярах

5.1.1. Оборудование и реактивы

Для проведения испытания применяют: термостат ТМ-1 для микроскопа; термометр по ГОСТ 215—73;

термостат или ультратермостат, или баню водяную; секундомер по ГОСТ 5072—72; стекла предметные по ГОСТ 9284-—59; пипетки глазные и пастеровские;

трубочки стеклянные длиной 5—В см с внутренним диаметром 0,8—1,0 мм или катетеры от шприцов для искусственного осеменения короов;

натрий хлористый по ГОСТ 4233—66; синь метиленовую 0,01%-ный раствор; воду дистиллированную по ГОСТ 6709—72.

5.1.2. Подготовка к испытанию

5.1.2.1. Концентрацию спермиев в сперме определяют п< ГОСТ 20909.5—75.

5Л.2.2. Подвижность спермиев определяют по п. 2.3.

Раствор метиленовой сини тотсвят, растворяя 0,01 г метиленовой сини и 0,9 г хлористсго натрия в 190 мл дистиллированной воды.

5Л.З. Проведение испытания

На чистое предметное стекло, подогретое до 30—37°С, наносят 0,05 мл (каплю) спермы и добавляют теплой пипеткой такое же количество (каплю) 0,01%-ного раствора метиленовой сини, подогретой до 30°С. Смесь спермы с краской тщательно смешивают и набирают ее в теплую (30—37°С) стеклянную трубку, рассчитывая, чтобы высота столбика смеси составляла 2—3 см. Столбик смеси, не содержащий пузырьков воздуха, располагают в центре трубки.

Трубочку, заполненную смесью опер мы с метиленовой синью* помещают в термостат при температуре 37^±0,5°С на лист белой бумаги в горизонтальном положении. Записывают время начала испытания и окончания обесцвечивания метиленовой сини. При этом учитывают, что концы столбика (1—2 мм) обычно не обесцвечиваются.

5.1.4. Обработка результатов

5.1.4.1. Дегидрсгеназную активность спермы выражают в условных единицах.

За единицу активности принимают такую активность, когда 1 млрд, спермиев обесцвечивает за 1 мин 0,05 мл 0,01%-ного раствора метиленовой сини (0,000005 г порошка метиленовой сини).

5.1.4.2. Дегидр о геназную активность спермы (Д_а) ^в условных, единицах вычисляют по формуле

лг _. П_с */• С

Ма— ₁₀ >

где П_с — подвижность спермиев, баллы;

t —- время обесцвечивания метиленовой сини в опыте,мин;

С — концентрация спермы, млрд/мл;

10 — постоянный кээффициент.

За окончательный результат иопытания пр инимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений.

Допускаемые расхождения между результатами двух параллельных определений не должны превышать ±10%.

5.2. Метод определения д ег и д р о г е н а з н ой активности спермы в пробирках

5.2.1. Оборудование и реактивы

Для проведения испытания применяют;

термостат ТМ-1 для микроскопа;

термометр по ГОСТ 215—73;

термостат или ультратермостат, или баню водяную;

секундомер по ГОСТ 5072—72; стекла предметные п> ГОСТ 9284—59;

пипетки стеклянные вместимостью 1 мл по ГОСТ 12487—67; колбы стеклянные по ГОСТ 12487—67;

пробирки стеклянные вместимостью 5 мл и диаметрам 1 см;

синь метиленовую, 0,05%-ный раствор;

натрий лимоннокислый по ГОСТ 5.1314—72;

масло вазелиновое по ГОСТ 3164—52, х.ч.;

глюкозу по ГОСТ 4233—66;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709—72.

5.2.2. Подготовка к испытанию

5.2.2.1. Приготовляют глюкозо-цитратный раствор на прокипяченной дистиллированной воде, для чего растворяют в колбе вместимостью 1ОЮ мл 3 г глюкозы и 1,4 г лимоннокислого натрия.

Раствор доводят до метки водой.

5.2.2.2. Раствор метиленовой сини готовят на прокипяченной дистиллированной воде, растворяя в мерной кол 5 г вместимостью 100 мл 3 г глюкозы, 1,4 г цитрата натрия и 0,05 г метиленовой сини. Объем раствора доводят до метки.

5.2.2.3. Концентрацию спермиев определяют по ГОСТ 20909.5—75.

5.2.3. Проведение испытания

В чистую, подогретую до 30—37^еС стеклянную пробирку вносят 0,8 мл теплого (37—45°С) глюкозо-цитратного раствора, добавляют 0,1 мл 0,05%-ного раствора метиленовой сини и 0,2 мл спермы. Содержимое тщательно перемешивают и наслаивают очищенное вазелиновое масло в таком количестве, чтобы получился столбик масла высотой 0,5—1,0 см.

Пробирки со смесью ставят в термостат или в водяную баню при температуре 45°С и учитывают время обесцвечивания метиленовой сини.

Допускается одновременно определять показатель выживаемости спермиев при температуре 45*С. Для этого через каждые 10— 15 мин из пробирок берут пробу стеклянной палочкой и оценивают подвижность спермиев по п. 2.3.

5.2.4. Обработка результатов

Депидрогеназную активность спермы и коэффициент дегидро-геназяой активности вычисляют по пп. 5.1.4 и 5.1.5.

6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕЗИСТЕНТНОСТИ СПЕРМИЕВ К ХОЛОДОВОМУ ШОКУ

Сущность метода заключается в определении выживаемости спермиев после быстрого их охлаждения до температуры 1—3°С. 6.1.Оборудование и реактивы

6.1.1. Для проведения испытания применяют: микроскоп биологический марки МБИ или МБР по ГОСТ 8284—67;

термостат ТМ-1 для микроскопа;

стекла предметные по ГОСТ 9284—59;

стекла покровные размером 18x18 или 24X24 мм по ГОСТ 6672—59;

палочки стеклянные или пипетки пастеровские;

флаконы вместимостью 2 мл;

глюкозу по ГОСТ 6038—74, 6%-ный раствор.

6.2. Подготовка к испытанию

6.2.1. Перед началом работы готовят на прокипяченной дистиллированной воде 6%-ный раствор глюкозы, растворяя 6 г глюкозы в мерной колбе вместимостью Ю0 мл. Объем раствора доводят водой до метки. Приготовленный раствор разливают по 1—2 мл в пробирки или флаконы из расчета на каждую пробу спермы не менее трех пробирок.

Готовят ванну со льдом с температурой 2±ГС, в которую не менее чем за 5 мин до начала исследования ставят для охлаждения по две из трех пробирок. Третью пробу с 6%-ным раствором глюкозы ставят в термостат прй температуре 37—40°С.

Подвижность слермиев определяют по п. 2.3.

6.3. Проведение испытания

6.3.1. Одну-две капли неразбавленной спермы, выдержанной при комнатной температуре не менее 10 и не более 30 мин, вносят стеклянной пипеткой в пробирки иля флаконы с 6%-ным раствором глюкозы, охлажденной до 2±ГС, и в пробирку с раствором, подогретым до 37—40°С. Выдерживают 5 мин. Подвижность спермиев определяют под микроскопом по п. 2.3.

6.4. Обработка результатов

6.4.1. Резистентность спермиев к холодовому шоку (R_x ) вычисляют по формуле

п __ ^а\

где а\ — подвижность спермиев через 5 мин после внесения спермы в 6%-ный раствор глюкозы при температуре 2±1°С, баллы;

а₂ — подвижность спермиев через 5 мин после внесения спермы в 6%-ный раствор глюкозы при температуре 37—* 40^аС, баллы.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных •определений. Допускаемые расхождения между результатами параллельных определений не должны превышать ±10%,

Пример. Подвижность спермиев в 6%-ном растворе глюкозы при температуре 37—40°С — 8,0 баллов, а в растворе с температурой 2±1°С — 1,5 балла.

Следовательно, резистентность к холодовому шоку

**⁼НОГ=⁰’¹⁸-

ПРИЛОЖЕНИЕ 1 к ГОСТ 20909 4-75 Рекомендуемое

Форма журнала для записи результатов испытаний

ю

Стр. 10

ПРИЛОЖЕНИЕ 2 к ГОСТ 20909.4—75 Справочное

ПРИМЕР ВЫЧИСЛЕНИЙ ИНТЕРВАЛА ВРЕМЕНИ, ВЫЖИВАЕМОСТИ СПЕРМИЕВ В ЧАСАХ И АБСОЛЮТНОЙ ВЫЖИВАЕМОСТИ

СПЕРМИЕВ

(данные для расчетов взяты из журнала для записи результатов испытаний, приведенном в приложении 1)

1. Интервал времени на четвертый день испытания

. Т--Т₃ _ 120-48

t_A— 2 2 —36 ч,

выживаемость спермиев за этот интервал времени

1—7*36=252.

2. Выживаемость спермиев в часах

^ _Тп-Т_п__г 264—240

- ' ¹ /г-1”

нс

2

2

240-252 ч.

3. Интервал времени на девятый день испытания, когда установлена минимальная подвижность спермиев в баллах

Тпс-Т_п^ 252—216

.=18 ч.

2 2

4. Абсолютная выживаемость спермиев в трех повторностях составляет S₁₌=2_e*=108+216+288+252+216 + 180+72+48+I8=1398;

S_t=2_at=l 08+216+216+216+216+120 +48+18=1410; ^з=2_л/=Ю8+216+288+*288+288+216+180+56 ^48+18=1458.

Расхождение между минимальным (1398) и максимальным (1458) показателями абсолютной вживаемости спермиев составляет 60 или 4,3%. Следовательно, абсолютная выживаемость спермиев

S_cp—

Si+S_a+S_s 1398+1410+1458

3

3

— 1422.

Изменение № 1 ГОСТ 20909.4—75 Сперма быков неразбавленная. Методы биологических исследований

Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 08.06.81 № 2857 срок введения установлен

с 01.07.81

Пункты 2.1.1, 4.1.1. Заменить ссылки: ГОСТ 8284—67 на ГОСТ 8284—78, ГОСТ 6672-59 на ГОСТ 6672-75, ГОСТ 9284-59 на ГОСТ 9284-75, ГОСТ 4233-66 на ГОСТ 4233-77.

Пункты 2.1.1, 5*.2.1. Заменить ссылку: ГОСТ 5.1314—72 на ГОСТ 22280— 76.

Пункт 4.1,1. Заменить слова: «микропипетки стеклянные по ГОСТ 12487—67» на «микропипетки стеклянные».

Пункты 5.1.1, 5.2.1. Заменить ссылки: ГОСТ 5072—72 на ГОСТ 5072—79, ГОСТ'9284-50 на ГОСТ 9284-75, ГОСТ 4233-66 на ГОСТ 4233-77.

Раздел 5 дополнить новым пунктом — 5.1.4.3:

«5.1.4.3. Коэффициент дегидрогеназной активности (/(Да) вычисляют по формуле

(Продолжение см. стр. 236)

^КДа~Д_а ’

где Да — дегидрогеназная активность».

Пункт 5.2.1. Заменить слова и ссылки: «пипетки стеклянные вместимостью 1 мл по ГОСТ 12487—67» на «пипетки стеклянные вместимостью 1 мл по ГОСТ 20292-74», ГОСТ 12487-67 на ГОСТ 1770-74, ГОСТ 3164-52 на ГОСТ 3164-78.

Пункт 5.2.4. Исключить слова: «и 5.1.5».

Пункт 6.1.1. Заменить ссылки: ГОСТ 8284—67 на ГОСТ 8284—78, ГОСТ 9284-59 на ГОСТ 9284-75, ГОСТ 6672-59 на ГОСТ 6672-75, ГОСТ 6038--74 на ГОСТ 6038-79.

Приложение 1. Графа «Последовательные интервалы времени, t, н». Заменить значение: 26 на 36;

графа а. Для 12-го дня проведения испытаний заменить знак:—на ЕП (3 раза).

(ИУС № 8 1981 г.)